High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer一.研究配景化疗耐药是癌症治疗历程中的一浩劫题，研究肿瘤内遗传异质性是解决肿瘤耐药性的关键因素，而单细胞测序可以深入研究肿瘤内的遗传异质性。但现在尚未发现驱动耐药的遗传机制，因此作者开发了一种scChIP-seq方法，从单细胞染色质景观中展现细胞的身份，同时可通过通过H3K4me3（促进转录）和H3K27me3（抑制转录）区分染色质特征。二.分析流程三.效果解读1.scChIP-seq微滴操作流程图1ab：scChIP-seq的操作流程通过细胞、核酸酶、裂解液和油滴组成single-cell封装；通过毗连试剂、Barcode微滴和油滴组成封装。

随后举行混淆静置，获得核小体Barcode的微滴，随后举行免疫沉淀并测序。作者通过这种方法研究细胞内促进转录的核小体H3K4me3以及抑制转录的核小体H3K27me3的状态。图S1. scChIP-seq详细操作流程图S5a：展示发生融合事件的信号，其中第一个液滴信号为没有Bead的细胞信号，第二信号为液滴融合的信号，第三信号液滴原本信号，第四个信号为bead和细胞的信号，第五信号为有bead液滴信号。

作者通过实时监控控制测序信号的质量图S5b：展示了液滴中细胞荧光信号的强度（绿）和bead荧光信号的强度（红），以及可以准确获得及格样本的数量图S5c：统计H3K27me3和H3K4me3组卵白修饰scChIP-seq实验的液滴数量，说明有约33%的样本可以用于进一步研究图S5. 质量控制图S6a：作者为了确认每个液滴内核小体都源于一个细胞，作者对人类细胞和小鼠细胞混淆后举行液滴封装，发现封装的液滴绝大多数有物种特异性S6b：灰色为预计的封装数量；蓝色为小鼠细胞实际封装数量；红色为人类细胞实际封装数量；玄色为混淆细胞封装数量图S6. 验证scChIP-seq识别细胞的能力因此，通过融合、测序和质控三个步骤，作者获得了包罗核小体和带有条码适配器bead的液滴2.体外检测单细胞染色质景观作者对人Ramos细胞（B细胞）和Jurkat细胞（T细胞）举行了scChIP-seq实验图S7a：展示scChIP-seq测得每个bead上H3K4me3或H3K27me3差别信号强度细胞的数量图S7bc：通过对比B细胞H3K4me3或H3K27me3scChIP-seq多次实验的RPM，显示重复实验的RPM相关性良好，因此说明实验可重复图S7d：对H3K27me3scChIP-seq实验举行了t-SNE共识聚类，获得两个细胞簇图S7e：对1：1人B细胞和T细胞的混淆物举行H3K27me3 scChIP-seq然后聚类，说明 scChIP-seq可以区分T细胞和B细胞图S7f：通过对比bulk ChIP-seq数据和scChIP-seq数据，有大量重叠数据图1b：tSNE分析H3K4me3和H3K27me3scChIP-seq数据，可将B细胞T细胞分成两类，且与原本的细胞分类对应图1c：H3K4me3和H3K27me3在B细胞和T细胞联合的区域图1d：scChIP-seq和bulk ChIP-seq数据相关性的分析，相关性水平高因此，scChIP-seq可以作为检测染色质状态单细胞测序方法，可以高度准确区分以及判定细胞群之间的区别。图S7. 人B细胞与T细胞scChIP-seq实验图1. scChIP-seq流程与B细胞T细胞验证3.体内基质细胞中H3K27me3景观的多样性图2a：作者通过移植人类三阴性乳腺癌细胞到小鼠体内，构建移植瘤小鼠模型，然后通过卡培他滨治疗构建化疗耐药小鼠模型，并进一步将小鼠基质细胞与人类肿瘤细胞分散，然后举行H3K27me3 scChIP-seq、Bulk ChIP-seq和scRNA-seq。图S10a：通过PCA图确定最适合分类小鼠基质细胞reads的数量为1600图S10b：对所有样本举行共识聚类获得5个细胞簇图S10c：对每个细胞簇内部举行相关性分析图S10d：筛选细胞簇内相关性高的细胞，红色为scChIP-seq数据，玄色为外部数据，筛选出相关性高的数据图S10e：对图S10d筛选的数据举行进一步共识聚类图S10f：细胞簇数量从2到10的细胞内相关性分析，发现将细胞分成3簇平均相关性最好图S10g：对scChIP-seq所有细胞举行共识聚类，获得了3个细胞簇图S10. scChIP-seq共识聚类详细方法图2b：作者对包罗化疗敏感和化疗耐药小鼠基质细胞举行共识聚类，获得3种染色质差别的细胞：Chrom_c1，Chrom_c2和Chrom_c3图S11a：左图通过对比某一簇细胞与另外两簇细胞富集和耗竭区域的差别，进一步确定H3K27me3在每一类细胞联合的位置，中图和右图，通过GO富集分析在Chrom_c2和Chrom_c3细胞中H3K27me3耗竭的功效图S11b：左图展示Chrom_c2中H3K27me3耗竭位点，涉及Col3a1基因；中图和右图，对scChIP-seq和scRNA-seq举行Col3a1RNA或相关表达展示，在Chrom_c2区域中，Col3a1基因低表达，说明Chrom_c2和Chrom_c3群体具有特定H3K27me3富集的位点图S11. 小鼠基质细胞scChIP-seq实验图2c：对化疗敏感和化疗耐药小鼠基质细胞的scRNA-seq 实验，作者获得了四个基质细胞群：其中两组为泉源于成纤维细胞的细胞群（Col12a1和Efemp1标志）、一组内皮细胞群（Pecam1标志）和一组巨噬细胞群（Ms4a7标志）作者进一步对TSS上下游1kb的序列举行进一步研究图2d：在基因座Ptk2上，scRNA-seq细胞群Chrom_c1和3测得H3K27me3信号强，而在scRNA-seq实验中Ptk2基因座H3K27me3信号强的是成纤维细胞群图2e：在基因座Lmp上，scRNA-seq细胞群Chrom_c2测得H3K27me3信号强，而scRNA-seq实验中内皮细胞H3K27me3信号强因此，作者通过scChIP-seq实验获得小鼠基质细胞的三个与H3K27me3染色质相关的细胞群，而且其中两个和scRNA-seq实验测得的转录组特征匹配图2. 构建耐药小鼠以及小鼠基质细胞scChIP-seq实验3.乳腺肿瘤中染色质景观的异质性作者对从小鼠分散获得人类三阴性乳腺癌细胞举行研究图3abc：对人类三阴性乳腺癌细胞举行共识聚类（3a），然后通过tSNE分析，发现分类后的2个细胞群Chrom_c1（敏感）和Chrom_c2（耐药），且与化疗耐药漫衍相似。

图S13a：展示了化学耐药人类三阴性乳腺癌细胞（HBCx-95-CapaR）与敏感细胞（HBCx-95）的拷贝数差别的区域，在chr15和chr18染色体上HBCx-95-CapaR拷贝数增加图S13b：通过scRNA-seq验证，共识聚类后主要依据化疗药敏性区分细胞群图S13c：确定了2个细胞群中细胞群间平均相关性最好图3d：所有细胞的 Consensus score Chrom_c2，其中得分越靠近1则越有可能为Chrom_c2细胞群，发现有少数 HBCx-95细胞得分高，可能与化疗耐药有关图3e：通偏激山图对比Chrom_c2和Chrom_c1，获得在Chrom_c2中染色质中有569个区域H3K27me3下调，114个区域H3K27me3上调图3f：展示所有染色质漫衍差别区域中，基因的情况，其中有34个基因被scRNA-seq验证在两种细胞群中有区别，其中在Chrom_c2中有两倍变化的基因为：上调基因DMKN、PDE4A、COL4A2、TMEM176B和IGF2BP3；下调基因C1orf21。图3ghi：在耐药相关基因（IGF2BP3）和EMT相关基因（COL4A2和HOXD）的基因座上Chrom_c2的H3K27me3信号弱，同时使用scRNA-seq验证。

说明Chrom_c2细胞群中耐药基因与EMT相关基因高表达图S13. 人三阴性乳腺癌细胞scChIP-seq实验效果图3. 三阴型乳腺癌染色质景观4.在未经治疗的肿瘤中检测到“抗药性”染色质亚克隆作者又举行了雌激素受体阳性的乳腺癌小鼠移植瘤耐药模型（HBCx-22和HBCx-22-TamR）举行验证图4a-d：使用HBCx-22和HBCx-22-TamR重复图3a-f实验，可以通过染色体特征分成两个细胞聚类（图4ab），同时有部门未经治疗HBCx-22显示出Chrom_c2高得分，可从HBCx-22中筛选出化疗耐药的细胞（图4c），统计了两种亚型染色质漫衍差别区域的数量，以及筛选出染色质漫衍差别的含有TSS区域的基因为EGFR、IGFBP3和ALCAM图4e-g：使用scRNA-seq检测基因差异情况，对scRNA-seq检测效果举行分类（图4ef），展示scRNA-seq分类细胞的通路情况，RNA_c6簇（HBCx-22泉源）显示出耐药通路的激活和基底样基因标志的激活（图4g）图4hi：展示了基因EGFR与IGFBP3的染色体状态与转录物状态，两种检测方法都显示在HBCx-22部门细胞存在化疗耐药性因此，通过两种检测方法，可以检测到化疗敏感肿瘤细胞中存在耐药细胞，同时展示了耐药细胞转录组和染色质水平的非遗传特征。图4.. 雌激素受体阳性乳腺癌scChIP-seq实验效果小结 最后小结一下，在这篇文章中，作者首先先容了scChIP-seq的事情流程，然后通过人类的B细胞与T细胞举行验证scChIP-seq的分类准确性。

随后，作者构建小鼠化疗耐药模型，分散了小鼠基质细胞和三阴乳腺癌细胞，举行scChIP-seq和scRNA-seq，发现三阴乳腺癌细胞通过scChIP-seq实验并共识聚类后的细胞群与耐药漫衍相似，且部门未经治疗的化疗敏感细胞和耐药相关，而小鼠基质细胞则没有这个效果。最后，作者通过雌激素受体阳性的乳腺癌小鼠移植瘤耐药模型，进一步验证了却论，可从未经治疗的化疗敏感细胞中找出耐药细胞。

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